高山被孢霉合成脂肪酸的主要NADPH供应基因的比较研究

脂肪酸在多个领域发挥着非常重要的作用,尤其对于人体健康而言更是不可或缺。目前其主要来源有植物提取、深海鱼油和微生物提取等。植物提取由于生长周期长、造价昂贵且只能生成短链脂肪酸而逐渐被淘汰。深海鱼类更是面临着环境保护、海洋污染等一系列问题。由于高山被孢霉安全性较高、脂肪酸产量较为丰富、多产长链脂肪酸等一系列特征,逐渐成为微生物产油的目的菌株。截止到现在,国内外对高山被孢霉的研究主要集中在菌种的筛选和发酵条件的优化上,对脂肪酸合成过程中关键酶基因调控机制的研究较少。本研究通过构建编码谷氨酸脱氢酶基因GDH（Glutamate dehydrogenase）同源过表达菌株和编码谷氨酰胺合成酶基因GS（Glutamine synthetase）基因沉默菌株,对GDH在脂肪酸合成过程中的作用进行了初步探讨。同时对目前已知的NADPH（Reduced nicotinamide adenine dinucleotide）主要来源基因研究结果,结合GDH基因产还原力分析,对其进行了比较研究。主要结论如下:（1）成功构建了同源过表达菌株Mortierella alpina-GDH1、Mortierella alpina-GDH2。对其性质进行测定主要结果如下:与对照菌株相比,GDH1和GDH2的平均表达水平分别为对照菌株的9.74倍和13.67倍;GDH1过表达菌株中NADPH含量增加了28.5%、GDH2过表达菌株增加了44.6%;过表达GDH1、GDH2菌株中总脂肪酸平均含量较对照菌株分别增加了10.4%、21.5%;GDH1过表达菌株中油酸增加了28.7%,亚麻酸增加了16.7%。GDH2过表达菌株中油酸增加了29.4%,亚麻酸增加了17.0%。综合以上结果表明,过表达GDH促进了脂肪酸合成过程中所需还原力NADPH的产生,同时提高了其脂肪酸含量和不饱和度。（2）应用RNAi（RNA interference）的方法,成功构建了重组高山被孢霉Mortierella alpina-i GS。实验结果如下:与对照菌株相比,Mortierella alpina-i GS菌株中,GS基因的表达量降低了60%左右;Mortierella alpina-i GS中NADPH含量增加了35.7%;总脂肪酸含量增加了19.9%;在一定程度上提高了油酸、亚麻酸含量。综合以上实验结果表明,GS基因对高山被孢霉脂肪酸合成过程有一定的调控作用,这也与过表达GDH基因的结果相吻合。（3）本文综合多篇文献研究,对NADPH主要来源基因产NADPH及脂肪酸能力进行了比较,当NADPH主要来源基因表达量均上调50%时,不同基因过表达菌株的脂肪酸含量、NADPH含量有较大差异。其中GDH2对NADPH含量影响较大,仅次于G6PG2。从另一方面说明了GDH基因可能是被忽视的为脂肪酸合成产NADPH的另一关键限速酶之一,对脂肪酸含量具有非常重要的影响。

基本信息

题目	高山被孢霉脂肪酸合成主要NADPH供给基因比较研究
文献类型	硕士论文
作者	武迎春
作者单位	河北工程大学
导师	郝光飞,韩东飞
文献来源	河北工程大学
发表年份	2021
学科分类	基础科学
专业分类	生物学,生物学
分类号	Q933
关键词	高山被孢霉,脂肪酸合成,谷氨酸脱氢酶,过表达
总页数：	66
文件大小：	2476k

论文目录

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 高山被孢霉简介

1.2 多不饱和脂肪酸简介

1.3 多不饱和脂肪酸的功能

1.3.1 预防心血管疾病

1.3.2 调节免疫

1.3.3 构成细胞膜

1.3.4 抗炎作用

1.3.5 其他作用

1.4 多不饱和脂肪酸的微生物来源

1.4.1 产油细菌

1.4.2 产油真菌

1.4.3 产油藻类

1.5 微生物脂肪酸合成过程简介

1.6 NADPH的主要来源

1.7 RNAi技术简介

1.8 研究内容及意义

1.9 技术路线

第2章 GDH对高山被孢霉脂肪酸合成的影响

2.1 材料与设备

2.1.1 实验所需菌株

2.1.2 实验材料及试剂

2.1.3 实验所需仪器和设备

2.1.4 实验所用引物序列

2.1.5 实验所需培养基配方

2.2 实验方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 总RNA质量的测定

2.2.3 反转录

2.2.4 扩增目的基因

2.2.5 PCR产物纯化

2.2.6 提取载体质粒

2.2.7 目的基因、载体单酶切

2.2.8 酶切产物纯化

2.2.9 重组载体构建

2.2.10 重组载体导入大肠杆菌

2.2.11 根癌农杆菌感受态的制备

2.2.12 重组载体导入根癌农杆菌

2.2.13 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉

2.2.14 基因表达水平的分析

2.2.15 脂肪酸提取及分析

2.2.16 NADPH提取及分析

2.3 结果分析

2.3.1 GDH过表达载体的构建

2.3.2 重组高山被孢霉菌株的筛选与鉴定

2.3.3 过表达菌株中GDH基因转录水平变化

2.3.4 过表达菌株中NADPH含量变化

2.3.5 过表达菌株中脂肪酸含量的变化

2.3.6 过表达菌株中NADPH主要来源基因表达量变化

2.4 本章小结

第3章 GS沉默菌株特征及NADPH主要来源基因比较

3.1 实验材料及设备

3.1.1 实验所需菌株

3.1.2 实验材料及试剂

3.1.3 实验所需仪器和设备

3.1.4 实验所用引物序列

3.1.5 实验所需培养基配方

3.2 实验方法

3.3 结果分析

3.3.1 沉默载体的构建

3.3.2 重组高山被孢霉菌株的筛选与鉴定

3.3.3 沉默菌株中GS基因转录水平的变化

3.3.4 沉默菌株中NADPH含量变化

3.3.5 沉默菌株中脂肪酸含量变化

3.3.6 沉默菌株中NADPH主要来源基因表达量变化

3.4 高山被孢霉NADPH主要来源基因的比较

3.5 本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间申请的发明专利

致谢

作者简介

参考文献

[1] 壮通饮抑制NADPH氧化酶2对糖氧剥夺诱导星形胶质细胞损伤的保护作用[J]. 亚太传统医药 2020(09)

[2] NADPH氧化酶在神经退行性疾病中的作用[J]. 国际神经病学神经外科学杂志 2015(04)

[3] 2种食用菌NADPH氧化酶A蛋白结构分析[J]. 中国食用菌 2020(08)

[4] NADPH oxidase inhibitor apocynin attenuates ischemia/reperfusion induced myocardial injury in rats[J]. China Medical Abstracts(Internal Medicine) 2013(01)

[5] NADPH氧化酶基因与先天性甲状腺功能低下症[J]. 实用糖尿病杂志 2019(06)

[6] NADPH氧化酶介导的小胶质细胞活化在神经病理性疼痛和抑郁共病中的作用[J]. 临床麻醉学杂志 2017(06)

[7] 镉/铬胁迫对谷子幼苗生长和NADPH氧化酶及抗氧化酶体系的影响[J]. 农业环境科学学报 2016(02)

[8] 调节NADPH对虾青素生物合成促进作用的研究[J]. 科技创业月刊 2015(20)

[9] NADPH氧化酶介导的氧化还原信号转导在高同型半胱氨酸血症中的作用及分子机制[J]. 细胞生物学杂志 2009(05)

[10] 中药抑制NADPH氧化酶的研究进展[J]. 中国中药杂志 2017(23)

[11] 基于己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共表达的辅酶NADPH高效再生[J]. 微生物学通报 2016(12)

[12] 抑制NADPH氧化酶对心血管疾病保护作用研究进展[J]. 中华实用诊断与治疗杂志 2016(10)

[13] 茶多酚对力竭运动小鼠心肌NADPH氧化酶及活性氧代谢的影响[J]. 中国医院药学杂志 2011(03)

[14] 阻断肾素-血管紧张素系统对糖尿病大鼠内脏脂肪组织NADPH氧化酶和iNOS表达的影响[J]. 中国糖尿病杂志 2009(02)

[15] 阻断辅因子NADPH合成对谷氨酸棒杆菌生长及产物合成的影响[J]. 食品与发酵工业 2019(10)

[16] NADPH氧化酶和活性氧在心血管疾病中的作用[J]. 海峡药学 2013(07)

[17] NADPH氧化酶家族与高血压血管重构[J]. 国际病理科学与临床杂志 2013(05)

[18] 奥美沙坦酯对心肌梗死小鼠NADPH氧化酶的作用[J]. 山东医药 2011(04)

[19] NADPH酶及活性氧与男性勃起功能障碍[J]. 中国男科学杂志 2009(03)

[20] NADPH oxidase 2 does not contribute to early reperfusion-associated reactive oxygen species generation following transient focal cerebral ischemia[J]. Neural Regeneration Research 2016(11)

[21] NADPH氧化酶在电磁辐射生物效应中的作用[J]. 生物化学与生物物理进展 2014(12)

[22] 晚期糖基化终产物诱导人近端肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1表达上调并活化NADPH氧化酶[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2009(08)

[23] 心房颤动心房肌β_3-肾上腺素能受体通过NADPH氧化酶产生氧化应激研究[J]. 新医学 2019(12)

[24] NADPH氧化酶4在骨癌痛模型大鼠背根神经节中的作用[J]. 神经解剖学杂志 2020(05)

[25] 普罗布考对心脏微血管内皮细胞eNOS脱耦联与NADPH氧化应激途径的影响[J]. 医药导报 2012(08)

[26] 血管紧张素Ⅱ对自发性高血压大鼠外周血单个核细胞NADPH氧化酶2表达的影响[J]. 实用医学杂志 2010(19)

[27] 高糖对人脐静脉内皮细胞NADPH氧化酶表达和活性氧生成的影响[J]. 中南大学学报(医学版) 2014(12)

[28] 姜黄素对大鼠角膜碱烧伤新生血管和NADPH氧化酶4表达的影响[J]. 临床眼科杂志 2015(03)

[29] NADPH氧化酶2活化介导脑内微清蛋白表达下降在小鼠脓毒症相关性脑病中的作用[J]. 临床麻醉学杂志 2015(07)

[30] NADPH氧化酶与肾结石相关性研究进展[J]. 临床泌尿外科杂志 2015(10)

相似文献

[1]衰老相关的NADPH-diaphorase阳性反应在鸽子和鼠类脊髓和延髓中的比较研究[D]. 贾云格.锦州医科大学2019

[2]辅因子NADPH调控谷氨酸棒杆菌合成L-赖氨酸时胞内微环境的生理机制[D]. 杨汉昆.江南大学2019

[3]表达NADPH和底物供应的关键基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响[D]. 张美玲.江南大学2018

[4]盐芥NADPH氧化酶F的基因沉默和功能研究[D]. 张莉.山东师范大学2009

[5]NADPH氧化酶参与盐胁迫诱导的烟草悬浮细胞活性氧的产生[D]. 张锦广.中国农业大学2005

[6]拟南芥微丝骨架动态调节盐胁迫诱导的NADPH氧化酶活性和活性氧的产生[D]. 刘尚刚.山东农业大学2011

[7]一种新型蓝藻NADPH脱氢酶亚复合体的鉴定及其生理功能的分析[D]. 高复旦.上海师范大学2011

[8]氧化葡萄糖酸杆菌中两个NADPH依赖的氧化还原酶基因的克隆表达及其酶学性质分析[D]. 陈珉珉.华东理工大学2010

[9]皮状丝孢酵母培养条件及油脂积累所需NADPH来源的初步研究[D]. 蒿珍珍.华东理工大学2013

[10]在乳糖发酵短杆菌中过表达NAD激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因对NADPH供应和L-异亮氨酸合成的促进作用[D]. 李坤.江南大学2013